Gesundheit

Die Beleuchtung der Genom: RNA-guided-endonuklease-in-situ-Kennzeichnung, eine neue CRISPR/Cas9 basiert molekulare Visualisierung Methode

Das CRISPR/Cas9-system hat schon Wellen in der wissenschaftlichen Gemeinschaft seit Ihrer Mechanismen wurden vorgeschlagen, im Jahr 2012. Gemeinhin als eine Genom-editing-tool, viele Wissenschaftler haben festgestellt, verschiedene Anwendungen für die scissor-like Eigenschaften des Cas9-proteins. Forscher vom Leibniz-Institut für pflanzengenetik und kulturpflanzenforschung (IPK Gatersleben) haben nun einen Weg gefunden, dass die RNA/protein-komplexe in einer etwas anderen Weise-als eine zytogenetische Fackel. Anders als in herkömmlichen in-situ-Hybridisierung, die neue RNA-guided-endonuklease-in-situ-labelling-tool (RGEN-ISL) setzt nicht mehr Voraus, Denaturierung der DNA. Die neue Methode lässt daher die chromatin intakt, wodurch die Untersuchung der Struktur der Probe. Darüber hinaus RGEN-ISL-kann kombiniert werden mit protein-Nachweis-Methoden und ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Kennzeichnung-Prozess. Während ursprünglich für die pflanzengenomen, JÜRGEN-ISL verwendet werden können, in allen Lebewesen vor und zeigt ein vielversprechendes, neues tool im Bereich des Chromosom Biologie.

Die Entdeckung der Typ-II-gruppierten regelmäßig interspaced kurze Palindrom repeats (CRISPR)-assoziierten caspase-9 (Cas9 -) system wurde ein Meilenstein im Bereich “ targeted genome editing. Ursprünglich abgeleitet von dem Bakterium Streptococcus pyogenes, das RNA/protein-komplexe nun ist ein etabliertes Werkzeug für die gezielte Genom-Bearbeitung in Eukaryonten.

Während seine scissor-ähnliche Eigenschaften haben, ergab eine Breite Palette von Anwendungen, Wissenschaftler vom Leibniz-Institut für pflanzengenetik und kulturpflanzenforschung (IPK Gatersleben) sind jetzt unter Verwendung CRISPR/Cas9 in eine neue zytogenetische Methode für strahlend ein Licht in eukaryote Genome — RNA-guided-endonuklease-in-situ-Kennzeichnung (RGEN-ISL).

Für die letzten 30 Jahre, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde das etablierte und Häufig verwendete Methode für die Visualisierung von in-situ-DNA-Sequenzen auf Chromosomen-Ebene. Diese Methode erfordert jedoch, Denaturierung der DNA untersucht, so ist oft eine Beschädigung der Struktur der Probe. Auf der Grundlage der JÜRGEN-ISL-Methode für CRISPR-Cas9, IPK-Forscher gelungen, die bypass-Denaturierung Schritt von FISCH, während Sie gleichzeitig die Integration der gewünschten fluoreszierenden Kennzeichnung Eigenschaften der konventionellen FISH-Methode. Als die neue zytogenetische tool behält die Struktur der Probe, es eröffnet die Möglichkeit der Untersuchung der räumlich-zeitlichen Struktur des Genoms.

Weitere Experimente zeigten, dass RGEN-ISL übertrifft herkömmliche Methode-Kombinationen, wie FISCH und Immunhistochemie, erfordert weniger Vorbereitung und ein vergleichsweise schneller und billiger. Darüber hinaus ist die neue Methode funktioniert über einer breiten Temperatur-Spektrum von 4°C bis 37°C und kann auch kombiniert werden mit zusätzlichen protein-Erkennung und der bildgebenden Verfahren. Ein weiterer Verdienst ist, dass RGEN-ISL ermöglicht Echtzeit-Visualisierung des CRISPR/Cas9-mediated DNA-Kennzeichnung, daher enthüllt die Kinetik der Reaktion.

Bisher haben die Forscher getestet, JÜRGEN-ISL in pflanzlichen Proben, sondern auch in den menschlichen Chromosomen, die veranschaulichen, dass Ihre neue Methode wahrscheinlich können angewendet werden in allen Organismen. Derzeit ist die Verwendung der Methode ist beschränkt auf repetitiven DNA-Sequenzen, wie Sie oft in pflanzlichen genomen. Jedoch, Dr. Takayoshi Ishii, arbeitet jetzt an der Tottori University (Japan), die konzipiert wurde die ursprüngliche Idee hinter RGEN-ISL, wird davon ausgegangen, dass diese Methode angepasst werden können, um zu visualisieren, auch single-copy-Sequenzen in die Zukunft.

Das Projekt rund um die neue Methode, die entwickelt wurde, unter research group leader Dr. Andreas Houben, wurde möglich gemacht durch einen Zuschuss für die CSIRO (Australien) von der Bill & Melinda-Gates-Foundation (USA) sowie auch Dank der zusätzlichen Finanzierung durch die DFG — DFG (Deutschland).

Aufgrund seiner Eigenschaften und der breiten Anwendbarkeit, JÜRGEN-ISL ist eine vielversprechende neue zytogenetische Werkzeug für die Förderung des Verständnis der räumlichen organisation des Genoms und die Verbindung zwischen der chromatinstruktur und-Funktion, sowie zur Förderung der Kenntnisse innerhalb des breiten Bereich von Chromosom Biologie.